植物DNA條形碼前沿探討

目錄

• 1、葛學(xué)軍：群落系統(tǒng)發(fā)育與DNA條形碼應(yīng)用

• 2、王雨華：植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)現(xiàn)狀

• 3、何興金：植物DNA條形碼與介子系統(tǒng)發(fā)育研究及其應(yīng)用前景

• 4、杭悅宇：植物DNA條形碼研究的瓶頸與思考

【精彩發(fā)言】

1、葛學(xué)軍：群落系統(tǒng)發(fā)育與DNA條形碼應(yīng)用

DNA條形碼的主要作用就是物種鑒定，特別是對(duì)采用傳統(tǒng)系統(tǒng)學(xué)方法難以鑒定的物種特別有用，例如，對(duì)于植物的幼苗、碎片、根系以及植物制成品(如茶飲料、中藥)等非常有用，對(duì)于一個(gè)區(qū)域內(nèi)物種的快速鑒定的作用也很大。由于目前分子系統(tǒng)學(xué)分析采用的主要片段，特別是APG系統(tǒng)采用的片段，很大程度上與條形碼片段相同。因此，應(yīng)用DNA條形碼的序列資料可以進(jìn)行類群的系統(tǒng)發(fā)育重建。此外，昆蟲的食性，如普食性昆蟲還是專一食性昆蟲，它們吃什么植物，以前很難進(jìn)行準(zhǔn)確定性，只能根據(jù)觀察進(jìn)行估計(jì)。目前，可以采用植物DNA條形碼引物，從昆蟲整體DNA中進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行序列測(cè)序、鑒定，從而了解昆蟲的食物是什么。最后，DNA條形碼目前在群落生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，在研究物種組成和維持機(jī)制方面應(yīng)用很多，是一個(gè)新的學(xué)科增長(zhǎng)點(diǎn)。

群落生態(tài)學(xué)主要研究群落內(nèi)物種共存機(jī)制。目前，研究的重點(diǎn)是確定究竟哪些因素，如環(huán)境過濾、競(jìng)爭(zhēng)排除，還是隨機(jī)滅絕，導(dǎo)致了現(xiàn)存群落的物種共存格局。傳統(tǒng)的研究方法很難將進(jìn)化歷史因素考慮進(jìn)去。以往群落生態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)這兩個(gè)學(xué)科的研究方向和內(nèi)容是相對(duì)分離的。Webb等首次將系統(tǒng)發(fā)育、性狀進(jìn)化和群落結(jié)構(gòu)三種分析相結(jié)合(Webb， 2000； Webb et al.，2002)，并列舉了一系列可解決的生態(tài)學(xué)問題。具體來說：①群落的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)分析；②生態(tài)位分化的系統(tǒng)發(fā)育基礎(chǔ)探討；③將群落內(nèi)容與性狀進(jìn)化及生物地理一起進(jìn)行分析。

Webb等(2002)定義了系統(tǒng)發(fā)育群落生態(tài)學(xué)這個(gè)新的學(xué)科。它的定義為：基于群落水平，運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)育分析方法來探討局域范圍(如樣地為尺度)內(nèi)物種共存和生物多樣性的維持機(jī)制，或者區(qū)域范圍內(nèi)(如不同氣候帶為尺度)不同類型群落的構(gòu)建規(guī)則。通過研究，可以確定群落的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)，即在一個(gè)樣方或生境內(nèi)，物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系是否為非隨機(jī)的，或者說，這些物種在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上是否具有關(guān)聯(lián)性，現(xiàn)在有充分的證據(jù)表明，植物個(gè)體之間的相互作用的確影響特殊類群的共存。

Webb(2000)采用兩個(gè)群落系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系指數(shù)—凈親緣指數(shù)(net relatedness index，NRI)和最近親緣指數(shù)(nearest taxon index，NTI)來描述群落的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)(有關(guān)這兩個(gè)指數(shù)的推導(dǎo)及計(jì)算過程詳見 Webb et al. ，2002)和Swen-son et al. ，2006 )。當(dāng)生境過濾作用是群落的主導(dǎo)過程時(shí)，群落主要由系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近的物種構(gòu)成，此時(shí)群落的NRI和NTI比較高；而當(dāng)種間競(jìng)爭(zhēng)是群落的主導(dǎo)過程時(shí)，群落主要由系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)的物種構(gòu)成，此時(shí)群落的NRI比較低，而NTI比較高。這兩個(gè)指數(shù)從不同側(cè)面反映了兩個(gè)相反的群落生態(tài)過程。

在DNA條形碼應(yīng)用之前，物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系通過采用基于APG系統(tǒng)的Phylomatic軟件進(jìn)行估計(jì)。Webb編寫了在線Phylomatic程序(http：//www.phylodiversity. net/phylomatic/phylomatic. html) ，用戶只需要輸人相應(yīng)格式的物種名錄，即可獲得基于APG系統(tǒng)的物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由于APG系統(tǒng)中數(shù)據(jù)量的限制，Phylomatic軟件通常只能解析到屬或科一級(jí)的水平。特別是對(duì)于熱帶群落，在種一級(jí)水平上大多數(shù)數(shù)據(jù)比較缺乏。這種估算存在許多弊端，即當(dāng)同一科屬下分類單元較多時(shí)，運(yùn)算結(jié)果會(huì)出現(xiàn)多分枝結(jié)構(gòu)(polytomy，給群落系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)分析帶來較大偏差，得出錯(cuò)誤結(jié)果的幾率升高。

用DNA條形碼序列構(gòu)建群落系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的優(yōu)勢(shì)在于，處理系統(tǒng)樹的末端分枝時(shí)能為分類單元提供準(zhǔn)確的系統(tǒng)位置，可根據(jù)所用的DNA片段計(jì)算整個(gè)群落內(nèi)所有類群內(nèi)部真實(shí)的分枝長(zhǎng)度。相比由Phylomatic軟件產(chǎn)生系統(tǒng)樹和采用Phylocom軟件中的“bladj”程序模擬運(yùn)算分枝長(zhǎng)度，基于DNA條形碼的分子系統(tǒng)樹在進(jìn)化樹的分辨率和進(jìn)化時(shí)間的準(zhǔn)確性上都更勝一籌。通過得到分辨率更高的系統(tǒng)樹，可以增加對(duì)于群落系統(tǒng)結(jié)構(gòu)零假設(shè)的檢驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

在巴拿馬BCI(Barro Colorado Island)50公頃的樣地內(nèi)有282種樹木，Kress等(2009)采用了rbcL， matK和trnH—psbA3個(gè)植物DNA條形碼構(gòu)建了該群落的系統(tǒng)發(fā)育樹。他們認(rèn)為，用3個(gè)植物DNA條形碼組成的超級(jí)矩陣重建的BCI大樣地群落內(nèi)物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其結(jié)果要比直接使用APGIII更好。其具體表現(xiàn)在：①在大的系統(tǒng)發(fā)育框架上，由DNA條形碼重建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與APG的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，樣地中所包含的全部24個(gè)目都被分配在適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)位置上，說明對(duì)于局域尺度下的植物群落而言，利用多片段條形碼組合所提供的信息可滿足系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，其效果已接近APG系統(tǒng)。②在系統(tǒng)發(fā)育框架末端(例如科、屬和物種水平上)，得益于3個(gè)DNA條形碼組成的超級(jí)矩陣(包含進(jìn)化速率快的片段trnH - psbA )，此時(shí)獲得的末端節(jié)點(diǎn)二歧分枝結(jié)構(gòu)比僅由Phylomatic自動(dòng)生成的多分枝效果好，說明在具體的樣地中，如果有充分的序列信息，加上科研人員的分類學(xué)背景知識(shí)，DNA條形碼可發(fā)揮出巨大的優(yōu)勢(shì)。通過利用Barcode Phylogeny和Phylomatic Phylogeny對(duì)樣地內(nèi)的7類生境進(jìn)行比較，Kress等(2009)得出了不同的群落聚集方式，他們認(rèn)為利用Barcode Phylogeny得到的結(jié)果更為可靠。

鼎湖山自然保護(hù)區(qū)是我國(guó)建立的第一個(gè)自然保護(hù)區(qū)，位于東經(jīng)112°30'112033' E，北緯23°09’一23°11' N，最高海拔1000. 3米，年均溫20. 9°C，平均年降雨量1929毫米。鼎湖山20公頃森林動(dòng)態(tài)樣地有60科，120屬，226種樹木。其中樟科植物23種，大戟科植物21種，茜草科植物15種，?？浦参?5種。由于大約66%的屬只有一個(gè)種，因此，容易采用DNA條形碼鑒定。通過采用rbcL ， matK和trnH一psbA三位點(diǎn)DNA條形碼片段，我們構(gòu)建了鼎湖山20公頃樣地的群落系統(tǒng)發(fā)育樹，并探討了群落內(nèi)不同尺度(20m x20m， 0. 04 ha； 100mx 100m， lha)的構(gòu)建方式。通過與Phylomatic構(gòu)建的群落系統(tǒng)樹得到的結(jié)果比較，采用DNA條形碼方法能更準(zhǔn)確地研究群落的物種組成與維持機(jī)制(Peiet al. ，2011)。

DNA條形碼的應(yīng)用主要反映在三個(gè)方面，一個(gè)是系統(tǒng)發(fā)育群落生態(tài)學(xué)，這個(gè)學(xué)科發(fā)展很快。在Web of Science上，以community， phylogenetic diversity， ecology為主題，截至2012年7月30口，一共查到243篇相關(guān)論文，其中很多發(fā)表在生態(tài)和進(jìn)化領(lǐng)域的頂級(jí)刊物上，如Ecology Letters ， Ecology， Molecular Ecol-ogy， Annual Review of Ecology， Evolution and Systematics。從發(fā)表年份上看，2010年以來發(fā)表論文數(shù)目快速增加，反映了這個(gè)學(xué)科的快速發(fā)展。

除了系統(tǒng)發(fā)育群落生態(tài)學(xué)以外，DNA條形碼發(fā)展對(duì)于群落系統(tǒng)發(fā)育與植物功能性狀的關(guān)系的研究發(fā)展也很快。利用分子系統(tǒng)發(fā)育樹，探討植物功能性狀的進(jìn)化及其與環(huán)境的關(guān)系是當(dāng)前生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。決定植物的哪些生態(tài)相關(guān)性狀是系統(tǒng)發(fā)育保守的，還是趨同的，在什么時(shí)間尺度上等問題，對(duì)于理解群落系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)的形成原因，以及進(jìn)化和生態(tài)系統(tǒng)后果非常重要。植物的功能性狀是植物系統(tǒng)發(fā)育歷史影響生態(tài)過程的一個(gè)重要聯(lián)系。最近，西雙版納熱帶植物園曹坤芳課題組在《全球生態(tài)學(xué)和生物地理學(xué)》( Global Ecology and Biogeography)上發(fā)表論文(Zhang et al. ， 2011)。他們通過對(duì)中國(guó)境內(nèi)98個(gè)采樣點(diǎn)618種樹木的木材密度和力學(xué)相關(guān)性狀的空間分布與環(huán)境因子和系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，所有11個(gè)木材性狀都表現(xiàn)出了顯著的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)，即受系統(tǒng)發(fā)育控制。他們研究認(rèn)為，我國(guó)森林樹木木材性狀的空間分布式樣受環(huán)境與系統(tǒng)發(fā)育共同作用的影響，系統(tǒng)發(fā)育影響物種的環(huán)境耐受性及其地理分布，并且年降雨比年均溫能更多地解釋木材性狀的空間分布。

DNA條形碼還與保護(hù)生物學(xué)密切相關(guān)。20世紀(jì)90年代，澳大利亞科學(xué)家Faith DP創(chuàng)建了一個(gè)生物多樣性參數(shù)，稱為“譜系多樣性”( phylogenetic diversity ，PD )。這個(gè)參數(shù)測(cè)量一個(gè)區(qū)域內(nèi)研究分類群的進(jìn)化途徑的長(zhǎng)度。以往我們研究一個(gè)區(qū)域生物多樣性時(shí)，通常只是比較物種數(shù)量多少、珍稀瀕危物種多少，很少考慮這些物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，也很難度量這些物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。DNA條形碼的應(yīng)用可以使得我們對(duì)一個(gè)區(qū)域研究類群建立系統(tǒng)發(fā)育樹，定量反映這些物種間的譜系多樣性。這個(gè)參數(shù)近年來被逐漸接受，并被應(yīng)用到保護(hù)生物學(xué)研究中。例如Forest等(2007)在Nature上發(fā)表論文，就采用此參數(shù)研究了生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)植物區(qū)系的進(jìn)化潛力。2012年中科院植物研究所馬克平課題組采用此參數(shù)研究了我國(guó)特有木本種子植物的多樣性，并鑒定了熱點(diǎn)地區(qū)(Huang et al. ， 2012 ， Diversity and Distribution ) 。

除了以上介紹以外，DNA條形碼還可以用來研究系統(tǒng)發(fā)育beta多樣性。該多樣性指的是任何兩個(gè)地點(diǎn)的生物個(gè)體間的系統(tǒng)發(fā)育距離(也即系統(tǒng)樹上的分枝長(zhǎng)度)，可以被看作是包含(演化)時(shí)間維度的beta多樣性(Graham & Fine ，2008 ； Gomez et al.，2010)。通過比較系統(tǒng)發(fā)育beta多樣性即不相似性，就可以分析出不同群落所處的生境類型及其相互作用關(guān)系，結(jié)合各自群落內(nèi)的物種組成，共同探討物種構(gòu)建機(jī)制、生物多樣性格局等諸多重要生態(tài)學(xué)問題。

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2、王雨華：植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)現(xiàn)狀

數(shù)據(jù)庫(kù)是植物DNA條形碼研究和建設(shè)的核心。在進(jìn)行DNA條形碼研究和建設(shè)中，無論是從測(cè)序開始，還是做物種鑒定、統(tǒng)計(jì)分析、系統(tǒng)演化等研究和應(yīng)用工作，最終都要形成數(shù)據(jù)并利用數(shù)據(jù)。因此，數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)是DNA條形碼研究和建設(shè)中的重要內(nèi)容。目前國(guó)際上做得最多的是動(dòng)物類群的DNA條形碼，在國(guó)際著名的數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站BOLD (barcode of life data systems)和GenBank中，植物類群的條形碼數(shù)據(jù)相對(duì)較少，中國(guó)DNA條形碼工作小組因在PNAS上發(fā)表論文而提交了1. 5萬條數(shù)據(jù)，從而成為最多的植物DNA條形碼數(shù)據(jù)提交者，這也從另一方面給了中國(guó)進(jìn)行植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)的機(jī)會(huì)。

不擁有DNA條形碼數(shù)據(jù)就會(huì)受制于人。從2009年起，BOLD啟動(dòng)了2. 5版新用戶界面和數(shù)據(jù)引擎，擁有大量的DNA條形碼數(shù)據(jù)，包括圖像、CPS、序列、測(cè)序圖譜等豐富的信息。同時(shí)，還內(nèi)置了許多分析工具，研究人員可以輕松利用這些工具分析序列重復(fù)度、分類地位準(zhǔn)確度、核背酸多樣度等。中國(guó)是國(guó)際生命條形碼四個(gè)中心結(jié)點(diǎn)之一，希望能與BOLD建立鏡像站點(diǎn)，但經(jīng)過多次努力之后，BOLD負(fù)責(zé)人仍然沒有答應(yīng)讓中國(guó)做到網(wǎng)站和數(shù)據(jù)的鏡像。

國(guó)家重大科學(xué)裝置—中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)為我國(guó)植物DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)提供了條件和機(jī)遇。中國(guó)要利用DNA條形碼認(rèn)識(shí)、研究和利用自己的植物，就必須盡快建立自己的條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)(reference 1ibrary )。但必須解決兩個(gè)難題：①規(guī)范化采樣；②數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)站的建設(shè)。正在運(yùn)行的“中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)”首先解決了采樣難題，在此基礎(chǔ)上為數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)提供了大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和示范機(jī)會(huì)。在參考國(guó)際DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)的同時(shí)，結(jié)合中科院昆明植物研究所及其他參與單位承擔(dān)的生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)前期建設(shè)經(jīng)驗(yàn)，廣泛征求專家意見，從中國(guó)國(guó)情出發(fā)，兼顧國(guó)際化需求，進(jìn)行我國(guó)生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的研究和開發(fā)。首先，選擇分類基礎(chǔ)好，具有一定樣品積累，對(duì)我國(guó)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義和代表性的重要類群為對(duì)象開始建設(shè)。在一定經(jīng)驗(yàn)積累基礎(chǔ)上，進(jìn)行中國(guó)生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范研究，從而指導(dǎo)整個(gè)系統(tǒng)的建設(shè)。目前，已經(jīng)完成了適合中國(guó)團(tuán)隊(duì)、方便用戶整理數(shù)據(jù)的EXCEL模式的客戶端工具，完成了近6萬條DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)，初步建立了運(yùn)行服務(wù)網(wǎng)站，該網(wǎng)站能夠?qū)崿F(xiàn)數(shù)據(jù)的查詢、展示和序列比對(duì)等功能。在后續(xù)開發(fā)中，除了在3年內(nèi)盡可能建成中國(guó)常見植物物種標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)外，將重點(diǎn)放在模型工具的開發(fā)上，能為物種鑒定、科學(xué)研究提供更加方便、實(shí)用的工具。

植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)將帶動(dòng)“iFlora”的應(yīng)用。隨著信息化、網(wǎng)絡(luò)化的高速發(fā)展，人們的認(rèn)知方式已經(jīng)發(fā)生了很大的改變。認(rèn)識(shí)植物是人類認(rèn)識(shí)世界的強(qiáng)烈需求，當(dāng)我們到達(dá)西雙版納或麗江時(shí)，看到一個(gè)植物就要問這個(gè)植物是什么名字，作為普通公眾來說這是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)，因?yàn)槲覀兇蟛糠秩硕疾豢赡芟駞钦麇i院士一樣能有這么廣闊的知識(shí)，能夠馬上告訴你是什么植物。但隨著信息化的發(fā)展，隨著電腦及智能終端的推廣和應(yīng)用，達(dá)到吳征錳院士這種認(rèn)知植物的能力就越來越近了。這種觀點(diǎn)認(rèn)為，吳院士在這個(gè)認(rèn)識(shí)植物方面的智商可能是140，而一般人認(rèn)識(shí)植物方面的智商可能也就是60一80，這樣智商的普通人在認(rèn)識(shí)植物方面可能永遠(yuǎn)也趕不上吳征錳院士，但是現(xiàn)在可以用智能終端進(jìn)行輔助認(rèn)知，即終端設(shè)備能夠擁有160智商。即使普通人只有認(rèn)知植物的60的智商，如果能將人和智能終端巧妙地結(jié)合起來，說不定就能等同或越過吳院士的140的智商。今天上午西部植物學(xué)會(huì)議上李德侏老師談了在線植物志，談到DNA條形碼，進(jìn)而談到“iFlora"。可能目前我們還無法實(shí)現(xiàn)理想中的“iFlora"，但我們可以把《中國(guó)植物志》的信息、基于圖形分類的信息初步集成，讓人們借助智能終端進(jìn)行初步判斷。如蘋果應(yīng)用程序Leafsnap，就可以實(shí)現(xiàn)拍照葉形來識(shí)別樹木了。DNA條形碼的發(fā)展可以引發(fā)植物界認(rèn)知的模式，但真正做到可能還有一個(gè)很長(zhǎng)的路程，因?yàn)槟壳皽y(cè)序仍需要在實(shí)驗(yàn)室里做。不過，第三代測(cè)序儀正在研制，一旦形成芯片，" iFlora”的目標(biāo)就實(shí)現(xiàn)了。

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3、何興金：植物DNA條形碼與介子系統(tǒng)發(fā)育研究及其應(yīng)用前景

植物DNA條形碼與獨(dú)活屬分子系統(tǒng)發(fā)育

系統(tǒng)與進(jìn)化是生物學(xué)中最令人著迷的領(lǐng)域之一。人們一直想要知道，有哪些物種與我們共同生活在這顆星球上，這些形形色色的物種從哪里來，它們之間存在怎樣的關(guān)系，又怎樣演化至今，它們?cè)鯓訑U(kuò)散到世界每個(gè)角落。本研究從中國(guó)傘形科(Apiaceae)獨(dú)活屬(Heracleum)的系統(tǒng)發(fā)育出發(fā)，對(duì)其DNA條碼和分類進(jìn)行了系統(tǒng)研究和分類系統(tǒng)的修訂，進(jìn)而研究其起源和擴(kuò)散，并對(duì)已有的生物地理算法進(jìn)行了改進(jìn)。在此基礎(chǔ)上，提出了新的貝葉斯分析法和時(shí)間一事件曲線分析法并編制了軟件，從而能夠?qū)ι锏淖嫦确植肌⑿螒B(tài)學(xué)和生態(tài)學(xué)祖先性狀等進(jìn)行分析和重建。

獨(dú)活屬是傘形科(Apiaceae)芹亞科(Apioideae)環(huán)翅芹族(Tribe Tordylieae)的重要類群，全世界共有65一120種(按小種概念)。在中國(guó)，獨(dú)活屬共有29種4變種，主要分布在西南部的橫斷山區(qū)，其中19種1變種為我國(guó)特有種。很久以來，獨(dú)活屬都被認(rèn)為是一個(gè)自然的類群；然而在近年的分子系統(tǒng)學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究中，獨(dú)活屬已被證明并非單系群。已有的研究中盡管只涉及了少數(shù)中國(guó)的種類，但仍暴露出諸多問題：部分中國(guó)種類形成了獨(dú)立的世系且與模式種遠(yuǎn)離，有些種類甚至與其他屬交叉。對(duì)中國(guó)獨(dú)活屬植物進(jìn)行全面的系統(tǒng)發(fā)育研究，對(duì)解決該屬乃至環(huán)翅芹族的系統(tǒng)發(fā)育具有重要的意義。該屬的許多植物都具有藥用價(jià)值，對(duì)其分類學(xué)的研究也有助于中藥的正本清源。

獨(dú)活屬植物分布廣泛，在世界上有兩個(gè)主要分布中心：一是高加索地區(qū)，另一個(gè)是中國(guó)喜馬拉雅地區(qū)。其演化和遷徙與橫斷山區(qū)的避難所地位以及陸橋的變遷密切相關(guān)。在現(xiàn)有的生物地理學(xué)研究中，擴(kuò)散一隔離分化分析(Dispersal一Vicariance Analysis， DIVA)是應(yīng)用最為廣泛的方法之一。然而，DIVA方法無法估計(jì)系統(tǒng)發(fā)育樹的不確定性，而且會(huì)給出大量的等價(jià)結(jié)果。因此，我們?cè)贒IVA方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，并應(yīng)用到了獨(dú)活屬的生物地理學(xué)研究中。主要進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究。

(1)采集了獨(dú)活屬全部29種和4變種植物樣品，使用貝葉斯法和最大簡(jiǎn)約法對(duì)核糖體DNA ( nrDNA )ITS序列以及5個(gè)葉綠體的非編碼區(qū)序列(cpDNA )( rps16一trnK，rps16 intron，trnQ一rps16，rp132一trnL和psbA一trnH)進(jìn)行了分析?；贒NA條碼對(duì)獨(dú)活屬進(jìn)行了深人的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究，所構(gòu)建的ITS數(shù)據(jù)集包含了88個(gè)種，114個(gè)居群;當(dāng)歸屬的4個(gè)種被用作外類群，其中55條ITS序列為首次發(fā)表。cpDNA數(shù)據(jù)集包含了環(huán)翅芹亞族和當(dāng)歸屬的36個(gè)種42條序列，每條序列都由5個(gè)cpDNA片段拼接而成，全部cpDNA片段的序列均為首次發(fā)表。在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，部分采自橫斷山區(qū)的獨(dú)活屬種類都測(cè)定了不止一個(gè)居群，以此判斷這些種類的不同居群間已出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)差異，是否達(dá)到種級(jí)分類等級(jí)，以及在分子系統(tǒng)發(fā)育上是否具有清晰的種間界限。作為對(duì)分子證據(jù)的補(bǔ)充，研究了36種獨(dú)活屬植物及其近緣類群的果實(shí)結(jié)構(gòu)，將nrDNA和cpNDA進(jìn)行綜合分析，并結(jié)合果實(shí)形態(tài)和已有的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)進(jìn)行綜合分析，首次提出了狹義獨(dú)活屬的概念并總結(jié)出了環(huán)翅芹亞族的8個(gè)分支。研究結(jié)果部分支持了Mandenova的分組系統(tǒng)。多管組并非一個(gè)單系，我們不支持多管組的建立。不完全的譜系篩選和雜交，造成了核基因ITS和葉綠體基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹的不一致性。

(2)首次在亞族級(jí)水平的大背景框架下(環(huán)翅芹亞族)，對(duì)獨(dú)活屬及其近緣類群進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育、DNA條碼研究，給出了獨(dú)活屬及其近緣類群的分類修訂和狹義獨(dú)活屬分支的屬下分類系統(tǒng)，以及其他分支的屬下等級(jí)排列。現(xiàn)有中國(guó)獨(dú)活屬中有9個(gè)種被排除在的狹義獨(dú)活屬分支之外，它們是灰白獨(dú)活H.cauesceus，白亮獨(dú)活H. caudicaus，裂葉獨(dú)活H.millefolium，二管獨(dú)活H. bivittatum，尼泊爾獨(dú)活H. uepaleuse，云南獨(dú)活H. yuuuaueuse，大葉獨(dú)活H. olgae，貢山獨(dú)活H. kiugdouii和小金獨(dú)活H. xiapjinense。這9個(gè)種在系統(tǒng)發(fā)育樹中散布在四帶芹屬(Tetrataeuium，大瓣芹屬(Semeuovia)和當(dāng)歸屬(Angelica)的分支中。有兩個(gè)產(chǎn)自高加索地區(qū)的單型屬(Maudeuovia和Symphyoloma )也被包含在了狹義獨(dú)活屬中。小金獨(dú)活應(yīng)與法落海歸并，放人當(dāng)歸屬中；灰白獨(dú)活、白亮獨(dú)活及其變種、二管獨(dú)活、尼泊爾獨(dú)活、大葉獨(dú)活和貢山獨(dú)活應(yīng)轉(zhuǎn)移人四帶芹屬；裂葉獨(dú)活及其變種應(yīng)轉(zhuǎn)移人大瓣芹屬。修訂后的中國(guó)獨(dú)活屬共包括23種2變種，大瓣芹屬包括6種，四帶芹屬包括7種。

(3)使用S一DIVA方法對(duì)獨(dú)活屬的起源與遷徙進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：狹義獨(dú)活屬的起源地并非以前研究者所認(rèn)為的中國(guó)喜馬拉雅地區(qū)(尤其橫斷山區(qū))，而是起源于西古北區(qū)，從西古北區(qū)起源地在向外擴(kuò)散的過程中，獨(dú)活屬植物在歷史上可能通過三條路線完成其遷徙，從而形成了現(xiàn)有的地理分布格局。這三條遷徙路線為：①西古北區(qū)一東古北區(qū)一東南亞一西南亞；②從東南亞通過白令陸橋(Bering land bridge)到達(dá)北美；③西古北區(qū)通過北大西洋路橋( North Atlantic land bridge)到達(dá)北美。

DNA條形碼的應(yīng)用前景及展望

研究結(jié)果顯示，只要選擇DNA條碼的分子標(biāo)記合適，可以得出很好的結(jié)果，并解決系統(tǒng)學(xué)問題。通過植物DNA條碼研究的結(jié)論，可以反過來尋找形態(tài)特征上的間斷，即DNA條碼研究結(jié)果可以為分類服務(wù)。

在應(yīng)用中，植物DNA條碼究竟用多少個(gè)分子片段更合適，或在更高水平和種下水平中尋找？本研究認(rèn)為，宜采用組合DNA條碼，即核基因和葉綠體基因組合，可以達(dá)到預(yù)期效果。

由于植物種類多，要對(duì)中國(guó)所有植物的DNA條碼進(jìn)行研究需要加大研究經(jīng)費(fèi)投人力度。雖然有一些困難和問題，但通過植物分類學(xué)家的不懈努力，相信植物DNA條形碼的大廈，在不久的將來會(huì)建成的。

能否像動(dòng)物一樣找到一個(gè)或幾個(gè)通用的植物DNA條碼片段，或是利用核心DNA條碼，如何將DNA條形碼研究工作向前推進(jìn)一步，使之成為植物學(xué)界的一個(gè)標(biāo)志性成果，這都需要中國(guó)科學(xué)家不懈努力，在做好大量分類和系統(tǒng)育研究工作的基礎(chǔ)上，對(duì)植物DNA條形碼做出里程碑意義的貢獻(xiàn)。

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4、杭悅宇：植物DNA條形碼研究的瓶頸與思考

這兩天很多專家對(duì)條形碼研究的現(xiàn)狀及應(yīng)用前景作了很好的發(fā)言，對(duì)于研究的瓶頸問題也已經(jīng)有了諸多涉及，和大家重復(fù)的看法我這里就不再談。

目前國(guó)內(nèi)DNA條形碼的研究已廣泛開展，特別是在中科院昆明植物研究所的領(lǐng)銜和組織下的大協(xié)作項(xiàng)目，已經(jīng)取得了良好的研究成果。但是近年來此主題的研究論文數(shù)量劇增，尤其是對(duì)于小類群進(jìn)行DNA條形碼研究的論文，沒有正確認(rèn)識(shí)和運(yùn)用DNA條形碼，以至于一些刊物已經(jīng)表明不再接受類似主題論文的投稿。那么，除了對(duì)DNA條形碼的正確認(rèn)識(shí)、對(duì)現(xiàn)有片段的優(yōu)劣評(píng)價(jià)和選擇等問題，在植物DNA條形碼的研究中還存在怎樣的一些問題呢?

很多專家已經(jīng)指出，實(shí)驗(yàn)材料是DNA條形碼研究的基礎(chǔ)問題和根本問題，我們面對(duì)的植物是一個(gè)龐大的、復(fù)雜的體系，沒有正確的分類認(rèn)識(shí)和采集方法，就不能保證植物DNA條形碼的準(zhǔn)確構(gòu)建。

通過兩年多來對(duì)薯鎖科薯鎖屬(相關(guān)研究已發(fā)表于PNAS，PLoS ONE ) ，寥科何首烏(種下居群)、唇形科夏枯草屬、十字花科一些屬的DNA條形碼的研究，我想就DNA條形碼研究的實(shí)驗(yàn)材料體系談點(diǎn)認(rèn)識(shí)和體會(huì)。

對(duì)植物“種”在DNA條形碼研究中的概念的認(rèn)識(shí)

這個(gè)問題中包括了已獲得DNA條形碼的未知種、錯(cuò)定種如何定位，但較突出的問題是廣布種。對(duì)于廣布種，由于經(jīng)常無法進(jìn)行連續(xù)分布地采樣，因此往往會(huì)忽略連續(xù)變化特征而把1個(gè)種在分布區(qū)端點(diǎn)的居群鑒定為不同種，如夏枯草屬的夏枯草、硬毛夏枯草和山菠菜這3個(gè)“小種”，其多個(gè)分子標(biāo)記包括DNA條形碼4個(gè)通用片段完全一致；反過來看它們的形態(tài)特征區(qū)別，僅在莖毛被的多少及葉片的一些數(shù)量特征(相關(guān)研究已發(fā)表于Journal of Medicinal Plants Research )。這樣的問題在基于形態(tài)的分類中大量存在，因此，雖然DNA條形碼的鑒定目標(biāo)是種，但這些能獲得完全一致的條形碼的結(jié)果及分析值得關(guān)注，包括所選片段是否合適，實(shí)驗(yàn)技術(shù)有無問題，是否確實(shí)是同種的分類問題等。

植物遺傳特性的影響

比如專家們提到的多拷貝問題、自然雜交問題、倍性問題等，均會(huì)影響到DNA條形碼的研究結(jié)果，其中倍性問題尤其麻煩，例如薯鎖科的野生黃獨(dú)、薯鎖的染色體倍性有2，4，8直至64倍等，其同種不同倍性個(gè)體的4個(gè)片段DNA條形碼序列有的一致，有的有很大差異。因此，大量關(guān)于種的倍性的前期研究以及如何確定準(zhǔn)確的目的材料就成為DNA條形碼研究的難點(diǎn)。

居群?jiǎn)栴}

居群?jiǎn)栴}一直是植物研究材料采集中的重要問題，研究中發(fā)現(xiàn)，一些物種的DNA條形碼有些片段在居群間的差異大于親緣關(guān)系相近的種間，如盾葉薯鎖居群間及小花盾葉薯鎖(相關(guān)研究已發(fā)表于PLoS ONE )，而DNA條形碼有些片段在個(gè)體間的差異大于居群間，如何首烏全分布區(qū)居群及每居群各10個(gè)個(gè)體的DNA條形碼研究。因此，作為最小實(shí)驗(yàn)材料單位的個(gè)體，如何解釋或完好體現(xiàn)其窮舉性，怎樣采集是合理而有代表性的，是DNA條形碼研究的又一個(gè)難點(diǎn)。

一些特殊問題

如，雌雄異株植物是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，據(jù)報(bào)道，被子植物中有14620個(gè)種是雌雄異株植物，而雌雄異株植物在很多分子標(biāo)記或DNA標(biāo)記上存在差異，如薯鎖科植物。

再如，和化學(xué)成分相關(guān)聯(lián)的所謂化學(xué)型問題。蒼術(shù)在江蘇茅山采集樣品中以蒼術(shù)酮為主要成分，在湖北采集樣品中以蒼術(shù)醇為主要成分，研究表明，4個(gè)DNA條形碼片段中有2個(gè)在上述兩個(gè)樣品群體中存在明顯差異，當(dāng)然，究竟導(dǎo)致差異的原因是成分、環(huán)境還是居群遺傳特性，值得探討，但這里就提出是否應(yīng)該建立以植物模式標(biāo)本或模式標(biāo)本采集地的樣品為材料的“標(biāo)準(zhǔn)條形碼”。植物條形碼在植物生態(tài)學(xué)、進(jìn)化學(xué)、分類學(xué)上已漸漸顯現(xiàn)出研究的重要性但還很不完善，也因此成為了值得探索的、前景寬廣的領(lǐng)域。