防御素抗病機理探索及應用前景
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- 2020-07-03 15:08:08
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【簡介】
防御素是生物體抵御病原微生物的防御反應過程中產生的一類抗微生物陽離子短肽，它在自然界是廣泛存在的。防御素具有殺死細菌、真菌或者病毒等微生物并具有抗腫瘤活性的奇特功效，其特殊的毒性機理使得微生物難以產生抗性，所以防御素有望發(fā)展成為新一代的多肽抗生素藥物，從而解決目前日益嚴重的抗生素耐藥性問題。中科院遺傳發(fā)育所的科研人員近年來在防御素的抗病機理研究、應用研究以及通過基因工程技術開發(fā)研究等多個方面都取得了很大進展，本期沙龍圍繞防御素的抗病防病機理和基因工程生產應用方面展開討論，希望能提出新的觀點和建議。
【主持人致辭】
安錫培：我們這次沙龍主要是討論NP1抗病機理探索及應用前景，防御素是孫勇如老師在所里最早開始的，2003年部隊、潛艇、海軍都用過，發(fā)的手冊上都有我就不多介紹了，下面請王義琴做主講。
【主旨報告】
王義琴： 防御素的抗病機理及研究進展
各位領導、各位專家、各位老前輩上午好，非常高興有機會今天來講一下防御素方面的進展。我跟大家分享的是防御素抗病機理及應用進展。
防御素最早是由1980年美國的Robert Lehrer命名的，它是生物體在抵御病原體的防御反應過程中產生的一種能拮抗微生物和一些惡性細胞的小分子短肽。防御素通常由29 ～ 54個氨基酸組成,其中包括6～8個保守半胱氨酸,可通過半胱氨酸分子內二硫鍵使肽環(huán)形成反向平行的β片狀或α螺旋結構。
防御素分子結構穩(wěn)定且具有非常廣譜的抗菌活性，根據(jù)來源的不同,可分為動物防御素、植物防御素和昆蟲防御素。防御素分子結構穩(wěn)定且具有廣譜的抗菌活性，根據(jù)分子結構特征的不同,動物防御素可分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素3種。
α-防御素: 由美國Lehrer 實驗室1980 年從兔肺巨噬細胞中首先分離得到, 是一種陽離子性極強的小分子抗菌肽。α-防御素主要存在于哺乳動物有關組織和細胞中。α-防御素分子由29~35 個氨基酸組成, 富含精氨酸, 非常保守的6 個半胱氨酸以Cys-l-Cys-6、Cys-2-Cys-4、Cys-3-Cys-5 方式形成3 對分子內二硫鍵, 其中Cys-l-Cys-6 對二硫鍵連接N 端和C 端的半胱氨酸形成分子大環(huán), 所以α-防御素的一級結構一般為圓形。在兔的中性粒細胞中共發(fā)現(xiàn)有6 種α-防御素, 即RabNP-1、-2、-3a、-3b、-4、-5, 這些防御素總量占細胞蛋白質總量的15%~20%。
RaNP-1具有非常廣譜的抑菌譜，它對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、被膜病毒、真菌、梅毒螺旋體等等都有很強的抗性，所以對這么廣范圍的病原體都能有治療效果。
圖1. 兔防御素RaNP-1廣譜的抑菌譜
β-防御素也是由三對分子內的二硫鍵，形成的位置跟α-防御素不同，因此結構也不一樣。防御素的抗菌活性很強，但是在受到鹽濃度及血清成分影響下，α-和β-防御素的抗菌活性會降低, 但是只有12個氨基酸的θ-防御素的抗菌活性卻幾乎不受影響, 研究發(fā)現(xiàn)θ-防御素分子的環(huán)狀結構可能是其保持穩(wěn)定活性的原因。
與動物防御素相似，昆蟲和植物防御素的特點，昆蟲防御素也有三對二硫鍵Cys-1-Cys-4、Cys-2-Cys-5、Cys-3-Cys-6，但是植物防御素通常是有四對二硫鍵Cys-1-Cys-8、Cys-2-Cys-5、Cys-3-Cys-6、Cys-4-Cys-7。
防御素有如此廣譜的抗性是在生物長期進化過程中與疾病斗爭的結果。其抗微生物的作用機理可以分為抗菌作用機理、抗病毒的作用機理、細胞毒作用、免疫調節(jié)功能四個方面。
防御素抗菌的作用機理，目前有兩種不同的抗菌作用機理被提出,一種是獨立膜機制，另一種是防御素結合細胞內復合物的機制。獨立膜機制的觀點認為, 帶正電荷的防御素與帶負電荷的細菌細胞膜相互吸引，并相互結合，從而破壞了磷脂雙分子層的完整性，引起靶細胞膜出現(xiàn)裂隙?？煞譃槿齻€階段：(1)由靜電吸引。防御素與靶細胞膜結合。防御素帶正電荷,可通過靜電作用與帶負電荷的細菌膜脂層結合；(2)通道形成。帶正電荷的防御素分子或其多聚體則與細菌質膜上帶負電荷的磷脂頭部和水分子相互作用,顯著地增加生物膜的通透性。防御素作用于膜上形成穩(wěn)定的多個通道；(3)內容物外泄。通道形成后,防御素進入細胞內的同時,其他胞外分子也伴隨進入(如肽、蛋白質或無機離子),而靶細胞的重要物質(如鹽離子和大分子)滲出，細胞膜的通透性及細胞能量狀態(tài)受到了破壞，導致細胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及細胞ATP含量下降, 離子和大分子物質通過細菌的細胞膜, 最終導致靶細胞死亡。
圖2. 防御素的抗菌機理。
防御素與細胞內復合物結合，2013年在美國科學院院報PNAS上有篇文章報道發(fā)現(xiàn)人類β-防御素2在革蘭氏陽性菌糞腸球菌毒力因子局部合成點高度聚集，從而破壞轉肽酶Sortase的定位并影響了它的功能，導致毒力因子合成受阻，而破壞細菌的分裂達到殺菌的作用。
防御素抗病毒的作用機理，分三類：閉門羹、突破口、地雷陣。
閉門羹-阻止病毒入侵宿主細胞，病毒感染細胞采用“兩步走”政策：首先，病毒的外衣即包膜死纏爛打地粘著到細胞的外膜上；接著，病毒包膜與細胞膜融合在一起。兩個膜融合后，病毒就將它的遺傳物質插入到細胞中。防御素則斜插在糖蛋白上以防病毒向細胞糖蛋白的擴散，讓病毒吃個“閉門羹”無法進入細胞。沒能進入細胞的病毒接著會被免疫系統(tǒng)的細胞摧毀。
突破口-殺滅病毒，防御素通常帶多個正的凈電荷，而病毒囊膜及其表面糖蛋白通常帶負電。這使得防御素像一塊塊小磁鐵，吸附到病毒囊膜帶負電荷的糖蛋白上。這樣便使囊膜病毒穿孔，形成突破口，內容物外泄而死亡。這與防御素對細菌的殺滅作用相類似。
地雷陣-阻止病毒基因復制與轉錄，萬一病毒進入細胞內，防御素可以與細胞膜表面促腎上腺皮質激素 (ACTH)，人硫酸肝素糖蛋白（HSPG），低密度脂蛋白受體（LDLR）等相結合，從而啟動G蛋白偶聯(lián)型受體的級聯(lián)放大反應，進一步激活磷酸激酶C。這些細胞信使作用就像埋伏在胞內的地雷，可以阻止整合到宿主基因組之前的病毒復合體進入細胞核或者阻止病毒的基因轉錄。整合不到宿主基因組的病毒隨后被摧毀。病毒雖然進入細胞，但是碰到地雷就被阻止了，整合不到基因組就被消滅掉了。
隨著研究發(fā)現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)防御素有細胞毒作用，它對人的淋巴細胞、實體瘤細胞毒作用更顯著的，近些年來，發(fā)表了一系列的這方面的研究文章。早在1993年，在我們國家的《中國病理生理雜志》，就有一位科技工作者做了兔中性細胞防御素的細胞毒研究，隨著濃度的升高，RaNP-1和RaNP-2對HL-60細胞系的毒性是逐漸增強的。對抗 TNF 的 U9TR 細胞、抗NK細胞細胞毒因子的小鼠淋巴瘤 YAC-1 細胞和人組織細胞淋巴瘤 U937 細胞具有殺傷性。在體外，HNP可抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶的活性，HNP的細胞毒活性部分依賴于靶細胞膜脂質成分的代謝活性，它還可以與過氧化氫酶協(xié)同誘導細胞毒作用。體外觀察純化防御素對人及小鼠數(shù)種腫瘤細胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)防御素對白血病細胞系、淋巴瘤細胞系及實體瘤細胞均具有細胞毒作用，并且這種抗腫瘤功效與其作用時間和劑量呈正相關。
防御素的免疫調節(jié)作用，防御素能夠作為一種效應分子激活巨噬細胞、DC、氣管上皮細胞等細胞表面受體從而啟動獲得性免疫系統(tǒng)，并將先天性免疫和獲得性免疫有機連接。防御素可以上調巨噬細胞趨化因子表達并進一步招募T細胞、單核細胞和未成熟樹突狀細胞（DC）和觸發(fā)適應性免疫控制病毒感染。通過防御素腫瘤機理防御素是自身防御體系重要的組成部分，組成機理非常獨特的，是通過電荷上去的，病原物不能產生抗藥性。
下面簡單介紹防御素研究進展，一個是防御素功能研究進展，在醫(yī)學、食品工業(yè)畜牧業(yè)、還有防御素的基因工程研究進展。
防御素在醫(yī)學中的研究進展，與口腔黏膜疾病的關系、與炎癥性腸病的關系、與慢性阻塞性肺部疾病的關系、防御素的臨床藥用研究。
防御素與口腔黏膜疾病，研究發(fā)現(xiàn)，防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫應答過程中發(fā)揮著重要作用，與多種口腔黏膜疾?。谇粷儭⒈馄教μ\、白斑及口腔念珠菌病等）關系密切。現(xiàn)今關于這方面的研究尚處于起步階段，主要以體外實驗為主，其作用機制也多為推測。感受到病毒侵染的信號，人的黏膜上皮細胞會產生防御素β-defensin-2 (HBD2) and HBD3 來抵抗病毒。
防御素與炎癥性腸病的關系，研究發(fā)現(xiàn)，腸道上皮細胞中防御素起著影響腸道黏膜的天然屏障作用，防御素表達水平的降低會導致黏膜細菌附著并入侵機體引發(fā)炎癥反應。腸道慢性炎癥疾病克羅恩?。–D）和潰瘍性結腸炎（UC）均與回腸潘氏細胞防御素HD-5、HD-6 的表達相關異常相關。原理是什么？2012年在Sciene發(fā)表的研究結果顯示以防御素為主的免疫分子能夠制造納米網(wǎng)捕捉沙門氏菌等腸道微生物。
防御素與慢性阻塞性肺部疾病的關系，HBD-2 與呼吸系統(tǒng)疾病關系緊密，在肺部黏膜防御中具有重要作用。研究證實，HBD-2 的產生或作用被抑制后，機體將發(fā)生肺部感染，人為補充外源性防御素可能會阻止細菌的定植和感染的發(fā)生。已有研究證實，重組 HBD-2 對肺損傷具有保護作用，可減少綠膿桿菌感染大鼠肺組織的菌落數(shù)。
最近一篇文章是在豬里面表達β-防御素2基因（β-BD-2）增強對胸膜肺炎放線桿菌的抗性，野生型豬的肺部顯示出血、水腫，嚴重的擁塞和嗜中性粒細胞浸潤。轉基因的豬肺部表現(xiàn)出輕微出血，中度充血，輕度中性粒細胞浸潤。
防御素有獨特的機理，微生物不容易產生抗藥性，抗菌譜廣，所以它在臨床上有非常大的藥用潛力。2008年，全球首個防御素藥物（PMX-30063）在加拿大獲得批準并進行一期臨床試驗。PMX-30063藥物的特色，全新的作用機制，細菌不易產生耐藥性；對革蘭氏陽性和陰性菌均有活性，特別是對包括89種耐藥葡萄球菌在內的146種葡萄球菌有抗菌活性；是一種殺菌劑，即能直接殺滅細胞而且殺菌速度快于許多抗生素；對耐藥菌有活性，包括多種耐萬古霉素和耐甲氧西林的臨床分離株。從而有望解決日漸增多的細菌耐藥性問題！
基于昆蟲防御素的新分子設計，動物所朱順義研究組通過單點突變將昆蟲防御素羧基端β-折疊片層結構改造成典型的β-發(fā)夾肽結構,獲得的14aa的小肽命名為NvBH。研究發(fā)現(xiàn)在低的微摩爾濃度下，NvBH無論在完全氧化或部分氧化的狀態(tài)下均有較強的抑菌活性（包括一些耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌臨床分離株)。NvBH具有低的溶血性和高的血清穩(wěn)定性和蛋白酶抗性，使其成為一個新型的抗感染類藥物先導物。希望他們早日研發(fā)成功。
防御素在食品工業(yè)中的可能應用，防御素具有耐熱的特點，作為食品防腐劑可用于熱加工食品的防腐保鮮。此外，它還可被用于防止巴氏殺菌后的再污染。
防御素在畜牧業(yè)中的研究進展，目前來講我們國家畜牧業(yè)養(yǎng)殖過程當中，抗生素添加劑的使用嚴重破壞了動物腸道的微生態(tài)平衡，藥物殘留也影響了畜產品的品質和人類健康，而來源于哺乳動物的防御素相對分子質量較小，熱穩(wěn)定性和水溶性均較好，可以在腸道內吸收。由于防御素屬于多肽成分，在體內容易被蛋白酶降解為氨基酸，動物采食后在體內一般無殘留?？梢蚤_發(fā)成環(huán)保型防御素飼料添加劑或獸藥。目前已經有很多商品型的重組β-防御素在進行銷售了。
防御素的基因工程生產，以轉基因小球藻為生物反應器生產兔防御素的研究具有自主知識產權，處于國際領先地位。小球藻是一個單細胞藻類，培養(yǎng)很簡單。轉基因小球藻的高效生物反應器特別有效，因為小球藻單細胞、培養(yǎng)簡單；繁殖速度快、可大規(guī)模培養(yǎng)；無內毒素；蛋白、多糖含量高，營養(yǎng)價值高；可作為高效生物反應器平臺。
另外也有研究用酵母系統(tǒng)大規(guī)模重組表達防御素，除此之外，防御素在農業(yè)中可用于農作物抗病育種研究。我們課題組2001年將兔防御素 NP-1轉入小麥植株，田間抗病蟲鑒定結果顯示小麥對于白粉病、葉銹和條銹病的抗性均有較大提高。而將兔防御素 NP-1基因構建至植物表達載體中獲得轉基因番茄的抗病實驗結果表明，其對番茄青枯病具有抗性，為番茄的抗病育種工作奠定了基礎。玉米防御素PDC1抑制了禾谷鐮刀菌的生長，效果還是非常明顯的。另外在小麥里面過表達植物防御素MtDef4.2的轉基因小麥可顯著增強對小麥葉銹菌的抗性。
防御素的功能并不僅限于防御，目前隨著研究進一步發(fā)現(xiàn)防御素功能非常廣譜，HNP可成為兒童體重指數(shù)和腹部脂肪沉積的經典標記物，另外一個β-防御素基因突變會導致家犬毛色的變化這些結果拓展β-防御素的功能作用。所以說防御素的功能研究目前只是發(fā)現(xiàn)冰山一角，更多的功能等待發(fā)掘。
【交流與討論】
安錫培：我們所從孫老師到胡老師做了20年做的是α-防御素。它的抗菌活性特別強，我記得2003年還幫著做在海軍的潛艇，用在海軍潛水隊員身上，非常有效，一噴就好，尤其是口腔潰瘍真正是有效的。飼料應用也很快，飼料催肥不用其他的東西代替。我們這次沙龍院老科協(xié)主要領導都來了，王局長、李局長、桂局長，還有我們所的胥書記和老書記宋秋生。在座有6個同事參與過這個事情，我們現(xiàn)在根據(jù)王義琴的主旨報告討論一下，大家有哪些不明白，哪些需要可以進一步討論，請大家暢所欲言。
王貴海：聽了王義琴的報告，介紹很系統(tǒng)，應該說防御素是生物體內的，在動物、微生物普遍存在的一個對外防御體系的重要組成部分。生物體系防御體系是多方面，這么一個重要的生物學的防御機制，而且防御素是一個小分子多肽蛋白，機制還是都比較清楚的。它的作用機制是獨立發(fā)揮作用還是跟免疫系統(tǒng)聯(lián)合發(fā)揮作用？ 我關心的這么重要的蛋白α、β防御素，在機制研究方面好像沒有在生物學上形成熱點，為什么？第二個是問題在在生物體內它是維持一個穩(wěn)定的含量，還是在應答時表達出來了呢？比如說細菌感染、病毒侵蝕它的表達量就高起來了，是α還是β多？作為應用發(fā)方面，前途又如何？如果在抗病毒方面有特殊作用那很不錯，因為它有三種防御機制，進來可以堵，到了細胞可以影響轉錄，最后是地雷，整個非常好的一種抗病毒的策略。你們做的是小球藻反應器表達量多少？
胡贊民：目前小球藻中防御素的表達量可以達到每升100毫克。
王貴海：那還可以，因為是多肽，可能不穩(wěn)定。
趙世民：這么好東西為什么沒有應用，如果是藥應該往哪個方向發(fā)展，比如說鬧肚子、腸炎，黃連素就解決問題了，花不了幾塊錢，如果用防御素去解決問題那錢要花很多了。我們應該瞄準其它的藥解決不了，只有它才能解決的病，國際上炒這么熱，胡老師和陳總一直堅持下去搞了很多工作。還有一個就是小球藻，作為植物反應器來講不產生手性的問題，治病就治病不會產生其他副作用，那小球藻反應器非常重要。
胡贊民：防御素在應用上也不是說沒有進展，進展挺大的，像臨床一期、二期都有在做，我覺得問題有兩個方面，一個是生產成本太高，現(xiàn)在防御素化學合成活性很低，因為有幾個二硫鍵，要從生物里面提取含量非常低的，有時候是誘導性的，一感染量就上來了，平常量很低，生產成本是一大塊，化學合成有護舷的問題。
王貴海：二三個二硫鍵合成起來應該不困難，這么好藥物多貴都沒關系。
胡贊民：目前的問題是合成的防御素活性很低，可能跟二硫鍵在體外不能正確配對有關系。
王貴海：復性試驗做過沒有，加熱破壞二硫鍵，然后復性，二硫鍵怎么樣，做過嗎？
胡贊民：功能沒喪失，煮開了防御素的功能也不會喪失。還有泡在酒精里防御素的功能也不變。
王貴海：這么皮實的東西，真不錯! 因為多肽藥物就是不穩(wěn)定、嬌氣，但是它的作用很好，你們這個多肽藥物這么穩(wěn)定在應用開發(fā)是非常方便的，你們在動物身上做過實驗嗎？
孫勇如：防御素做成藥，小球藻平臺建立起來，我能生產小球藻還能生產凝血因子，說明這個平臺在基因藥物里面非常有價值的，現(xiàn)在小球藻問題是1995年上了國家科技攻關項目，這個是非常非常不容易，上去了。但是到十五就沒有了，整個國家科技攻關統(tǒng)統(tǒng)取消，只剩下一個項目，所以我們組沒有延續(xù)下去。直到2005年實際上別的經費來維持它，做再深入研究很難。應該說我一直看好這個項目，但是發(fā)展還是有些慢。
王貴海：小球藻就是一個表達體系，分離提純太難了，得率很低。
孫勇如：關鍵是基因工程，當時那個時候報道美國有酵母生產人的防御素，生產出來沒有活性。我們的項目成立的時候這是一個對比，那個時候還沒有。
王貴海：小球藻有活性嗎？
孫勇如：當時報道沒有，所以選了小球藻。因為藻類里面能夠規(guī)模培養(yǎng)的原核里面是螺旋藻，真核里面是小球藻。
胡贊民：我接著說說生產的問題，這么多年建小球藻的系統(tǒng)，可以培養(yǎng)10噸級，表達防御素的很多。所以用它去做少量的動物實驗是可以的，目前更看重的是小球藻表達系統(tǒng)不經過提純直接應用，因為小球藻本身是可以吃的，提高免疫力，提高動物的健康和產量那也很好。所以我們弄了一個發(fā)現(xiàn)，藥也可以做，為什么現(xiàn)在防御素現(xiàn)在沒有一個藥能夠成功的，我想有一個很重要的原因，就是活性沒有完全解決。
有一個像臨床實驗馬甘寧，最后做了很長時間，從青蛙身上提取的，最后它的有效性和劑量跟有毒性劑量接近就槍斃了。防御素有個缺點有血清的情況下就失活，未來做要藥物是口服的，或者是外用的，做系統(tǒng)用藥還是沒問題的。
安錫培：我們這個階段討論就到這里，大概提了幾個問題重要的機理和藥理研究，還有關于小球藻反應器的也值得研究，為什么防御素沒有形成很好的藥物關鍵是毒性沒有解決，現(xiàn)在這個階段就到這里，下面請陳宇紅做演講。
【邀請報告一】
陳宇紅：兔防御素NP-1規(guī)?；a及其應用研究
各位專家、各位老師上午好，我主要把我們研究室在防御素這幾年做的不同方向研究結果向大家匯報一下。
兔防御素(Netrophile Peptide-1，NP-1)：來自兔嗜中性粒細胞，33個氨基酸，α防御素，由非常保守的6個半胱氨酸形成三對二硫鍵。二硫鍵的正確配對直接影響到防御素的活性。理化性質分析：溶于水和乙醇；經100℃處理5分鐘后其生物活性未變化；經pH 3.0處理12小時的生物活性未變化；37℃下經胃蛋白酶消化（pH3.2）12小時的生物活性也未發(fā)生變化。 因為有很穩(wěn)定性質，對它應用奠定了基礎。
防御素NP-1規(guī)?；a和轉基因安全評價，我們利用發(fā)酵罐可以規(guī)模生產NP-1，在10噸發(fā)酵罐中159小時，轉NP-1基因小球藻干重達105.57每千克，其中NP-1達到105毫克每升，產量遠高于文獻報道。轉基因安全評價我們已經獲得農業(yè)部環(huán)境釋放許可，并通過環(huán)境部環(huán)境中心檢測致敏性分析、急毒實驗、慢毒實驗和三致實驗。
防御素NP-1研究分為以下幾點。第一個小球藻表達NP-1可以提高靶動物的免疫力促進其生產量，項目來源是國家“十二五”科技支撐計劃防御素NP-1中試生產關鍵技術及其在飼料添加劑中的應用研究。有效性研究，以白羽肉雞作為靶動物，參試組至少包括陰性對照組、抗生素組、對各組雞進行空腹測量體重，推薦劑量（1% NP-1藻粉），比陰性對照組（野生藻類粉）增重11.5%；比抗生素組5.4%，多倍劑量組（1% NP-1藻粉）與推薦劑量組無顯著差異，證明了推薦劑量組作為飼料添加劑喂白羽肉雞具有有效性，并且可以替代抗生素。
安全性實驗，多倍劑量組的血生化、血常規(guī)、、臟器系數(shù)、肌肉率、組織病理學以及骨髓分析未見異常，證明了推薦劑量組作為飼料添加劑飼喂白羽肉雞具有安全性。
十二指腸病理結果，陰性對照，絨毛短粗、排列松散，提示吸收功能較弱； NP-1兩組，絨毛細長，排列緊密，提示吸收功能較強。 統(tǒng)計學分析結果：絨毛長度、V/C 比值 CK組 和NP-1各組差異顯著。NP-1兩組之間差異不顯著。
十二指腸病理切片情況，這是千分之一，這是百分之一的NP-1，我們看到腸道有很多小黑點是淋巴系統(tǒng)，免疫細胞比陰性對照組多，腸道免疫就很強，陰性對照組看到比較多的中性粒細胞，吞噬細胞比較多，粉紅色的細胞是嗜酸細胞，腸道的情況揭示了有炎癥反應，有輕度過敏。脾臟的病理結構，兩個NP-1組出現(xiàn)了脾小體，陰性對照白脾不多，而是紅脾的比較多。
我們通過糞便菌群的情況，我們百分之一跟千分之一NP-1的對照組，淡綠色的是益生菌或者是非致病，抗生素跟陰性百分比增多了，腸道免疫也是非常好的狀態(tài)。經過上面分析，我們現(xiàn)在初步認為這可能就是造成靶動物在出欄時生物量增加的原理，這是一個初步探討。
小球藻表達的NP-1具有廣譜的微生物抗性，項目來源“十二五”國家科技863計劃，小球藻表達兔防御素NP-1臨床前研究，應用方向是生物醫(yī)藥，我們通過研究做了細菌、真菌實驗，像淋病奈瑟氏菌、對沙門氏菌引發(fā)的感染有明顯療效等等。
這個是小球藻表達NP-1對多種真菌臨床分離株抑菌效果，株系是北醫(yī)三院真菌室的臨床分離株，采用10 mg的NP-1藥敏紙片對其有非常明顯的抑制作用，對照為含有醋酸的緩沖液。小球藻表達的NP-1對多種霉菌抑菌效果；株系是中科院微生物研究所環(huán)境分離株，采用10 mg的NP-1藥敏紙片對其有非常明顯的抑制作用，對照為甲殼素。小球藻表達的NP-1對灰葡萄孢霉引發(fā)的草莓 腐爛的保鮮效果，對照組：僅用配料噴涂后96小時霉變率100%，實驗組：NP-1復配的保鮮劑噴涂后96小時霉變率20%?；蚬こ瘫磉_的NP-1對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的藥敏試驗，我們發(fā)現(xiàn)在每毫升8微克情況下有很好抑制作用，對照選的是頭孢西丁。我們同樣用這個菌又感染了大鼠，把大鼠后背平行切割，然后是接觸MRSA感染，開始給藥，治療5天后處死。之后做了病理切片，已經有新的表面形成，有結痂。小球藻兔防御素NP-1對MRSA形態(tài)結構的影響，這是進一步揭示了NP-1對細菌的殺菌機理。
小球藻表達的NP-1可以誘導上皮細胞、成纖維細胞有絲分裂修復創(chuàng)傷，合作單位306醫(yī)院，應用方向生物醫(yī)藥，表達NP-1可以修復ICR小鼠皮膚創(chuàng)傷，通過肉眼看得出來，實驗組傷口很小了，對照組傷口沒有任何愈合情況，處死以后做了病理切片，表皮在實驗組形成非常良好，沒有滲出。在實驗組里面沒有表皮形成，有滲出，肌肉下面組織有壞死了，可以看得出來傷口好重。
表達NP-1可以修復豚鼠的口腔黏膜損傷，就是口腔潰瘍，每日兩次NP-1 20毫克，76小時處理，潰瘍明顯減小，在對照組看的非常清楚，潰瘍清晰可見，實驗組里面鱗狀上皮完全愈合，沒有滲出，對照組沒有愈合，有明顯的滲出。
小球藻表達的NP-1可以直接促進損傷神經修復和再生，合作單位北京大學人民醫(yī)院，應用方向是生物醫(yī)藥。神經遞質L-谷氨酸的興奮作用相當程度上受兔防御素NP-1影響。防御素的作用機制可能涉及突觸傳遞的改變，且由神經遞質L-谷氨酸介導。5-羥色胺受體可能參與了NP-1與感覺神經元的相互作用。兔防御素NP-1與感覺神經元細胞膜相互作用的機制可能是通過防御素中第十四位酸性氨基酸Glu(谷氨酸)的羧基與膜受體形成氫鍵作用。對神經的保護功能可能是通過阻礙細胞凋亡，增加細胞增殖和促進中樞神經系統(tǒng)創(chuàng)傷愈合。
我們在大鼠的坐骨神經做一個套管，2個月會自動在體會吸收，中間留了5毫米縫隙，設置了3個組，一個是NP-1組，在套管里面100毫克的NP-1，第二個給了NGF，第三組是氯化鈉，持續(xù)8周實驗，測試了很多參數(shù)，像神經傳導率、老鼠走路步態(tài)等等?，F(xiàn)在給大家看一下神經元胞體逆行示蹤，氯化鈉神經形成的非常差，我們又做了有髓鋨酸染色，在一定波長下如果長出來就可以看細胞，NP-1和NGF經過統(tǒng)計學分析，也發(fā)現(xiàn)神經元胞體恢復沒差異，氯化鈉這一組基本上沒怎么形成。
以上是我們對NP-1不同應用方向進行一下探討，我們也很希望在下面的工作當中能夠獲得更多國家經費的支持或者是企業(yè)橫向資助，不管哪個方向都能夠促使項目真正做到產業(yè)化。在這個過程中非常感謝孫勇如、趙世民、 胡贊民老師的支持，國家863計劃，中科院重點部署項目、國家科技支撐計劃和保羅生物的資助，華中農業(yè)大學的支持和管理，參與本研究的中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所、北京大學醫(yī)學部、北京大學人民醫(yī)院，306醫(yī)院工作人員和學生。
【交流與討論】
安錫培：下面我們針對陳宇紅的報告進行討論，看看防御素目前在應用方面，還有哪些比較成熟的。
趙世民：我記得還有一個個例，胡贊民的同學孩子眼睛真菌感染，知道他搞這個，就跟他要了一點，他那個同學真敢干，就給他的孩子使用，后來孩子就好了，而且上學了，后來我就不知道怎么樣了，這是個例，起碼是對真菌感染有效。
魏榮瑄：我聽到是挺震撼的，還能抗防腐，假如說這樣的話，小肽的東西，又是廣譜的，開辟了一個很好的思路，這個是很鼓舞的。在一個小球藻表達系統(tǒng)很好，在北大困難時期說一個小球藻片頂一個饅頭非常的吸引人，這個系統(tǒng)結合藥物、廣譜性，再有小球藻表達系統(tǒng)很有應用性。
王貴海：我想問一個問題，它的應用前景非常好?！笆濉表椖孔鳛樵黾觿游锏目共⌒院痛龠M生長已經做了不少實驗，證明了它的有效性和安全性。有效性我注意到增長百分之十一點幾，抗病性是怎么做的？我看你做了很多病理切片，整體動物實驗做過嗎？
陳宇紅：我們分不同的應用方向，您說的有效性是我承擔的飼料添加劑的課題，實際上為什么體重會增多，通過病理切片發(fā)現(xiàn)腸道和脾臟免疫提高了，對病源微生物免疫，比如說腸道里的細胞的結構，提高的是機體的機能的。
王貴海：但一定要證明在個體水平上。對照組是怎么做的？
陳宇紅：我們做了一個對照野生小球藻對照組。
王貴海：要做感染組和感染對照組，看看發(fā)病的情況。經過嚴格的試驗，才能作為正式畜牧藥物和營養(yǎng)品上市，在組織水平上也要做大量的觀察，所有的試驗動物都要宰殺做病理。
陳宇紅：我們做了六個平行攔。
王貴海：你們是做雞的是嗎？
陳宇紅：對。
王貴海：100只雞太好做了，你可以試試做禽流感。
陳宇紅：我的課題主要是做飼料添加劑。
王貴海：這種飼料增加了免疫力，死亡率降低了。你的們病理切片很好、不錯的。產品的研發(fā)要作必須要按照規(guī)范去做，這是一個問題。第二個有效性，你說多倍劑量組沒有負作用，有多少倍？
陳宇紅：有一個推薦劑量組，認為按照這個劑量，多倍劑量組是5到10倍。
王貴海：增加有效性，沒有增加毒性。安全性一定要按照要求，多倍提法太含糊，增加百倍的飼料喂食動物，要做多長時間的觀察，審視對以后遺傳有沒有影響。
陳宇紅：您說的這個評價我們是做1000倍的。
胡贊民：王局長您說的非常好，作為飼料添加劑的話是靶動物安全性5倍、10倍是可以的，如果做毒性評價是小鼠，在小鼠里面是1000倍的。
王貴海：這個我是外行，數(shù)據(jù)要規(guī)范，要按照食品管理辦法去做，才能通過食品添加劑產品的證書。
胡贊民：還有農業(yè)部轉基因安全評價的。
王貴海：你們拿到的是什么？
陳宇紅：致敏性分析、急毒實驗、慢毒實驗，三致實驗。
孫勇如：為什么我們設計的時候小球藻表達兔防御素NP-1不表達了人防御素，就怕使用時間長了抗生素失效了。
王貴海：兔防御素NP-1就不耐藥了？
孫勇如：生產時為什么不生產人防御素而生產兔防御素NP-1，那樣對人沒威脅，對兔子就有威脅了，抗生素是一個大問題，本世紀初出現(xiàn)了萬古霉素，大家覺得抗生素不靈了，現(xiàn)在十幾年來了只增加了14個病理耐藥菌出現(xiàn)，大家比較信心。最近2014年11月份，中國報道了出現(xiàn)了對多元菌素B的耐藥菌出現(xiàn)了，這個菌2015年10個國家發(fā)現(xiàn)，到去年2016年又出現(xiàn)了耐藥性，這個耐藥性多元菌素出現(xiàn)了，大量應用在畜牧業(yè)上，利用非常廣泛，耐藥菌的出現(xiàn)了大家非?？只?。但是我們防御素有沒有效果，不知道。
胡贊民：現(xiàn)在防御素、抗菌素用于調節(jié)防御能力，我們用的劑量是一公斤飼料加一克小球藻，一毫克的NP-1，一公斤飼料里面只有一毫克的，它的劑量是殺不了菌的。
王貴海：它跟藻體結合以后，到了雞肚子里肽還存在嗎？
胡贊民：過了十二指腸以后，到了空腸以后就沒有了。
王貴海：到哪吸收的？
胡贊民：實際上是刺激腸道，刺激它免疫的反應，腸道細胞及反應，拉出來的時候沒有了。
王貴海：兔的防御肽吃了以后在什么地方吸收，要做防御素的生理代謝，一旦吃進去到胃里就變成氨基酸了，如果人吃多肽藥物是腸溶的，這個才起作用。用小球藻做兔子防御素做添加劑是非常好的想法，不用把兔防御素NP-1提取出來，表達就行了，定量就行了，規(guī)范做飼料小球藻粉，飼料標準定下來，多少克藻分，多少肽裝到袋子里就可以了，然后觀察產品的穩(wěn)定性。
胡贊民：我們一直想要做藥肽原理學。
王貴海：最好做藥代的研究，不用雞做，用老鼠做更方便。
趙世民：讓誰做都拿錢啊，所里經費是有限的，你找誰都要交錢的。
孫勇如：我曾經胃出血疼死了，就煮小球藻，煮開了喝了就特別好。
王貴海：這是我剛才的一個建議，盡快突破作為飼料研發(fā)，這個最容易突破的，完了以后這么多飼料不管是雞還是其他都有很大市場。
趙世民：您說的跟我們的思想真的不一樣。
王貴海：你要做藥會非常難，如果做飼料，市場效益也會非常好。所以這么好的東西一定要選一個很好的突破點，如果作藥， 必須要選擇一個合適的適應癥，然后一步步按成藥性研究。我看好你們這個防御素，目標一定要清，然后走一個非常捷徑的路，容易走。
安錫培：謝謝王局，王局每次都能說到點子上，下面請鄧婷婷博士發(fā)言。
【邀請報告二】
鄧婷婷：小球藻表達體系研究進展
小球藻作為它的特性和生物反應前面兩位報告人都提到了，易培養(yǎng)、生長快、成本低等等。小球藻跟其他生物細胞相比，有生產上的優(yōu)勢。目前用小球藻作為生物反應器轉化，用的啟動子、載體大部分來自于高等植物，也是真核生物。
小球藻報告和篩選基因有所體現(xiàn)，文獻用的最多是螢火蟲和綠色熒光蛋白比較多的等等，這些報道應用情況也不知道應用成為成熟，今天聽報告感覺防御素應用還是比較多的。
轉基因小球藻的表達水平和穩(wěn)定性受很多因素影響，外源基因表達水平低甚至表達被抑制的狀況經常發(fā)生；外源基因表達的最大困難是缺乏足夠的調控序列；另外，未使用偏好密碼子、不正確的聚腺苷酸化、不適當?shù)暮诉\輸以及不穩(wěn)定的mRNA，均可能導致基因沉默。
小球藻生物反應器的發(fā)展，優(yōu)化已建成的遺傳轉化體系，提高外源基因的轉化效率和表達水平，形成高效穩(wěn)定的外源基因轉化系統(tǒng)；深入開展小球藻的分子遺傳學研究，使其成為既具良好培養(yǎng)基礎和應用潛力，又具有清晰遺傳背景的新型研究體系。
小球藻應用展望，前幾個報告人都提到了，一作為生物反應器生產各類物質；二利用基因工程培育優(yōu)良藻種；三藻類天然產物的生產；四藻類基因在農作物改良中的應用。
我簡單講的就是這些，也比較淺顯，拋磚引玉，多交流。
【交流與討論】
安錫培：剛才鄧婷婷講了一下小球藻研究趨勢、應用和表達體系，我們根據(jù)她講的內容，結合前兩段再進行討論，大家看看還有什么提出的想法和問題。
孫勇如：我原來的想法希望小球藻作為生物反應器能夠越來越多的被應用，所以退休前2004年就寫了一篇文章《小球藻新型的生物反應體》，我希望大家能夠引起重視，除了這個防御素轉到小球藻，凝血基因轉到小球藻，如果這個平臺建好的話，基因工程藥物類是非常好的。防御素正確表達了，有功能了，用小球藻來證明到底行不行？最后表達了是有功能的，當然沒有最后成作用，總覺得這條路是通的，這個平臺作為基因工程藥，我覺得有很大優(yōu)勢，不光是一個新型藥，多生成一個藥來。但是以前沒做好，沒選擇抗癌的藥，跟藥一接觸就知道，人家一聽是抗癌有興趣我跟你合作，防御素跟抗癌沒關系就不想投錢，抗癌的藥喊的響，防御素沒喊響，我希望在這方面工作能夠繼續(xù)。
何鳳琴：你說抗癌，我是動物所的，今天特別感謝遺傳發(fā)育所的邀請，2005年以前接了一本書，讓我寫蒼蠅的研究，后來查出癌癥了，就不想簽合同了。我研究蒼蠅的抗菌肽、抗菌蛋白、防御素，我也是從北大出來的，我2005年退休的，退休以后我舍不得我那蒼蠅，兩個組一間房里，我后來腫瘤又復發(fā)了，長了五個以上腫塊，我后來就吃那個蛆，現(xiàn)在已經過去12年了，沒事兒了。
孫勇如：康富新（音）是從蟑螂提取的藥。
李文彬：是從蟑螂用酒精提取的，修復胃黏膜，美洲大鐮。
孫勇如：我覺得蛆里面起作用的還是抗菌肽。
湯火順：抗菌肽的作用很大，我做過法國蝸牛，一炒非常的香，外面的人聞到就找到我炒的地方來，你們在干什么炒的那么香，我就把這個蛆配合飼料養(yǎng)法國蝸牛，長的非常漂亮。我后來養(yǎng)牛蛙的時候就更好了，還沒有斷尾上陸地時候吃蛆長的非?？?。那個時候養(yǎng)了7個月蛙就達到1斤左右了。后來我把蛆加工完以后做剛才提到的抗菌肽的問題，和四個細菌和青霉素比較，都非常的有效。有的比青霉素抑菌效率更高，為什么要提到這個問題？因為蛆生長非?？欤敝撤浅？?、成本非常底，奶粉跟紅糖就可以了。
何鳳琴：現(xiàn)在我叫神蟲。吃完一喝水挺好的。
孫勇如：吃了幾天？
何鳳琴：一邊干活一邊吃，拿微波爐就成了，餓了就吃。
胡贊民：要直接提取的話也容易。
何鳳琴：提取費錢。
趙世民：這些可能要用綜合性的東西，真正提取出來以后，要分析它，藥在生物學怎么弄的，從哪排出來。如果不提取它，就像中藥似的，就混在一起吃了治病。
孫勇如：就像康富新的藥說明副作用，劑量什么尚不明確、原理是什么尚不明確，那藥理就批下來了。像胃潰瘍也是，康富新你喝了就行。
趙世民：我今天聽三位的演講，有了新的了解，做了多少工作，占了多大比例，對我們以后有啟示作用，哪些方面還沒有涉獵，我們應該在這個方面多下功夫，哪個方面做了大量工作，我們可以少在哪個方面工作。
我們今天是防御素的沙龍，也涵蓋了小球藻的使用，剛才王局長提了非常重要的一點，你要找一個急病，比如說現(xiàn)在小學、幼兒園大量的一陣一陣的發(fā)生口腔里面的?。ㄊ肿憧冢?，而且反復的發(fā)作，特痛苦，也沒什么藥，回來就是休息、喝水，到醫(yī)院檢查完了醫(yī)院告訴你好了才能上學。這些東西確實有用，就在這方面做一個必要開發(fā)，如果光提廣譜，一提廣譜人家覺得就是紅藥水什么都管用。瞄準一個開發(fā)一個，然后再找第二個。咱們國家藥品批下來也是相當難的，你要做好幾年的戰(zhàn)斗準備。我聽說美國一個新藥10億美元10年，中國是不是可以快一點，但是也需要投入大量的經費，所以咱們書記也在這，將來在這方面也跟所長研究研究，能夠對他們組看中一個項目給予一定資助，打響一炮。真的到一期臨床的時候，就不是遺傳發(fā)育所負擔得起的，就要找合作單位了。
孫勇如：那個是時候需要跟企業(yè)合作。
安錫培：我們時間正好，剛才世民算做了一個小結，我們現(xiàn)在看來它的潛力很大，也需要進一步完善，需要克服。
王貴海：我個人感覺今天的沙龍開的還是不錯的，從選題上作為具有免疫功能的重要分子，具有重要的理論研究和應用意義。作為免疫系統(tǒng)，分子作用機制很多還是不清楚的，在基礎研究、前沿研究當中有重要的研究價值的。我建議能不能在基礎研究當中深入做點東西，可以和別所分子免疫團隊合作。這是一個方面。
第二個建議，所里的老同志一直堅持在應用方向開發(fā)有價值應用前景的東西，承擔院里“十二五”項目，承擔國家項目，重點項目，也得到了支持。希望能夠集中方向，在原有比較好的基礎上有所突破。瞄準幾個方向。第一個比較重要就是在飼料添加劑方面，現(xiàn)在可以在企業(yè)方面運作，或者我們自己成立一個企業(yè)來推動這個成果。因為很多標準已經拿到了。但是你要作為一個飼料添加劑還有許多研究去做。如果做好了，打到國內市場、國外市場都可以的。
雞的抗病性對養(yǎng)雞產業(yè)來講很重要的。如果能在普通的流行性疾病上能夠起作用，如果搞一點研究能抗禽流感那就更好了。就是說，一定要選擇國家需求大的東西，做一些基礎性的工作。我覺得最近一條路做成飼料添加劑的高端產業(yè)是可以的。
在人類疾病研究來講，要選準方向，它對很多病都有作用，特別是作為免疫性分子對黏膜性疾病有作用明顯。但是選擇疾病最好是選擇現(xiàn)在還沒有好藥來治的病，根據(jù)防御素作為成藥研究的特點，怎么做最容易做，比如做外用藥，涂抹，包括皮膚、抗菌，弄好了跟創(chuàng)可貼弄在一起就很好，化妝品也可以。這些根據(jù)防御素本身多肽的特點，在成藥研究少走路，給老百姓解決大問題。所以在適應癥選擇問題上要好好想想，希望我們團隊繼續(xù)努力作出突破性工作。
